Auteur(s) : Thierry Jeanfaivre, Agnès Chassevent, Joël Geslin, Francis Larra, Edmond Tuchais, CHU, F-49033 Angers Cedex 01, France..
Résumé : Pour estimer la valeur pronostique de l'analyse cytométrique en flux, 61 cas de cancers bronchiques épidermoïdes opérés ont été étudiés en termes de contenu en acide désoxyribonucléique (ADN) et de pourcentage de cellules en phase de synthèse d'ADN (% S). Ces paramètres ont été déterminés sur des prélèvements chirurgicaux frais. Le % S a été obtenu dans 25 cas. L'index d'ADN (ID) et le % S ont été comparés à la survie et aux caractéristiques clinicopathologiques habituelles pour la prédiction de la survie. Le contenu en ADN classé en ADN-diploïde et ADN-aneuploïde n'est pas un facteur pronostique de la survie. Un ID supérieur à 2 semble prédictif mais nécessite confirmation. Le % S et la multiploïdie ne sont pas des facteurs prédictifs de la survie.
Mots-clés : cytométrie en flux, cancer bronchique épidermoïde, pronostic, survie.
Illustrations
ARTICLE
L'étude des variations génétiquement contrôlées de la réponse à un médicament, classiquement appelée « pharmacogénétique », est une notion relativement nouvelle. En 1957, Motulsky [1] montra que certains effets secondaires des médicaments pouvaient être causés par des variations enzymatiques génétiquement déterminées. En 1959, Vogel [2] proposa le premier le terme de pharmacogénétique et, en 1962, Kalow [3] écrivit la première revue sur ce sujet. Dans les 30 dernières années, plus de 100 exemples de réponse exagérée à un médicament, d'apparition de nouveaux effets secondaires ou d'absence d'efficacité d'une molécule donnée à des doses conventionnelles en relation avec des traits héréditaires individuels ont été observés. Plus récemment, des polymorphismes génétiques communs en rapport avec le métabolisme d'un médicament, comme le polymorphisme de la débrisoquine/spartéine, le polymorphisme de la méphénytoïne et les polymorphismes faisant intervenir une réaction d'acétylation, ont été étudiés extensivement, probablement parce qu'ils affectent le métabolisme de médicaments fréquemment utilisés en médecine et concernent un nombre important de patients [4, 5].
Jusqu'à des années récentes, les variations génétiques dans la réponse à un médicament étaient presque exclusivement déterminées par des méthodes classiques qui consistaient à étudier les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques à l'échelle de l'individu, de la famille, puis d'une population. La situation a quelque peu changé ces dernières années grâce aux progrès effectués dans la compréhension des structures et des fonctions des gènes humains. L'utilisation des techniques de recombinaison de l'ADN, pour l'étude de ces gènes et de leurs produits, a été une innovation majeure en médecine et en génétique humaine, et a permis une approche plus fondamentale du concept pharmacogénétique. L'implication la plus importante de ces techniques d'approche de l'ADN inclut l'élucidation et le séquençage de la structure des gènes impliqués, la définition des mutations qui entraînent l'absence ou la diminution des protéines participant à l'action d'un médicament et le développement de tests génétiques pour détecter ces mutations. Le tableau I montre les principaux mécanismes mis en jeu dans les déficiences quantitatives ou qualitatives d'une enzyme intervenant dans le métabolisme d'un médicament.
Notion de polymorphisme génétique
Le concept de polymorphisme génétique provient de l'observation que de nombreux traits phénotypiques comme le groupe sanguin, les groupes d'histocompatibilité (système HLA) apparaissent dans la population avec une fréquence qui ne peut être expliquée seulement par l'apparition de mutations. Plus de 20 % des protéines, dans chaque être humain, diffèrent dans leurs propriétés électrophorétiques par rapport à la protéine de référence [6]. La notion de polymorphisme ne peut se détacher de la notion d'évolution. Ainsi, le polymorphisme génétique peut expliquer qu'une modification de l'environnement (exposition à des produits chimiques ou autres) peut sélectionner un changement dans la population. Ces polymorphismes sont dus à des variants alléliques et sont caractérisés par une fréquence élevée d'hétérozygotes dans la population. Il est difficile de savoir par quel mécanisme une mutation peut être maintenue à un haut niveau de fréquence dans la population. Deux mécanismes peuvent être envisagés : soit un procédé de sélection naturelle qui favorise l'émergence d'une mutation, soit la présence de mutations « neutres » n'interférant que peu ou pas du tout avec la fonction de la protéine [7]. La fréquence des polymorphismes génétiques varie considérablement avec les régions du génome étudiées. De façon générale, plus la fonction du gène considérée est importante plus la fréquence des variations géniques est faible [8]. Il a été observé que les polymorphismes génétiques étaient préférentiellement identifiés pour des fonctions en relation avec l'environnement, comme le système immunitaire, les enzymes impliquées dans le métabolisme des médicaments et les processus d'inactivation d'agents chimiques de l'environnement. Par contraste, le multiallélisme est moins fréquent pour des gènes dont les fonctions sont en relation avec les processus de régulation ou de contrôle cellulaire [9]. Il est habituellement admis qu'un phénotype présent à une fréquence supérieure à 1 ou 2 % doit être considéré comme un polymorphisme ; cette notion est quelque peu arbitraire et ne tient pas compte du caractère homozygote ou hétérozygote du variant ainsi identifié.
L'analyse de l'ADN génomique par les techniques de Southern blot ou de PTFR (polymorphisme de taille des fragments de restriction) permet de révéler des polymorphismes au niveau de l'ADN qui reflètent directement le génotype, mais qui peuvent ne pas avoir d'influence sur le phénotype. Il apparaît que les définitions futures concernant les polymorphismes devront être aussi basées sur la fréquence de l'allèle modifié au niveau de l'ADN génomique. Beaucoup de ces polymorphismes identifiés au niveau de l'ADN (génotype) ne sont pas cliniquement importants car ils ne modifient pas la quantité ou l'activité de la protéine [9].
Interprétation d'un phénomène pharmacogénétique
En raison de la variabilité de la réponse clinique vis-à-vis d'une molécule chimiothérapique, un phénomène pharmacogénétique ne pourra être interprété qu'après étude préalable des paramètres suivants : (1) tout d'abord, il est nécessaire d'interpréter les données pharmacocinétiques de la molécule et de ses métabolites. La corrélation des concentrations plasmatiques de la molécule ou de ses métabolites avec les effets biologiques et cliniques est la première étape dans l'élucidation des mécanismes impliqués dans les variations cliniques observées après administration de la molécule. Ces variations peuvent être expliquées par des modifications de certains paramètres cliniques comme la fonction rénale, la fonction hépatique et l'état nutritionnel. La dose du médicament peut alors être adaptée à la fonction rénale, comme dans le cas d'un dérivé du platine [10, 11] ; (2) la deuxième étape consiste à identifier certaines enzymes clés intervenant dans le métabolisme d'un médicament. Si une base pharmacogénétique est identifiée pour un médicament, après comparaison des données métaboliques et cliniques, le (ou les) enzyme(s) responsable(s) de ce métabolisme doi(ven)t être identifiée(s). Cela peut être réalisé grâce à des études in vitro à l'aide de systèmes d'expression qui permettent d'identifier les enzymes responsables d'une action spécifique [12]. La combinaison de ces systèmes avec des inhibiteurs et/ou des inducteurs devrait permettre l'identification des enzymes prépondérantes dans la biotransformation du médicament. Une fois que l'enzyme est identifiée et purifiée, l'ADNc et/ou le gène codant pour cette enzyme peuvent être isolés, ce qui permet de rechercher des mutations pouvant expliquer les variations dans l'activité de cette enzyme.
Applications de la pharmacogénétique en oncohématologie
Prédisposition génétique au risque de cancer
Il est possible de définir en pharmacogénétique 2 types de réponses à un médicament, une réponse de type aigu et une réponse de type chronique. Habituellement, le phénotype qui induit une réponse aiguë n'est pas celui qui induit une réponse chronique. Le risque de cancer est considéré comme une réponse pharmacogénétique de type chronique. Ce risque de cancer secondaire peut être très variable suivant les individus, cette notion de risque repose sur des différences d'expression de gènes particuliers intervenant dans le niveau de régulation des enzymes. Un médicament particulier ou une substance toxique peuvent donner un risque de cancer chez un individu mais aussi être inoffensifs chez un autre individu [13].
Cette notion de risque génétique de cancer en rapport avec les enzymes de biotransformation peut être illustrée à l'aide de quelques exemples. Des différences génétiques dans certaines enzymes comme la N-acétyltransférase 2 (NAT 2) et le cytochrome P-450 (CYP) 2D6 peuvent exposer les individus à un risque plus élevé de cancer [14]. Dans une revue sur le sujet, Nebert [15] insiste sur 3 polymorphismes pharmacogénétiques : le système d'acétylation, le système débrisoquine qui explore le cytochrome P-450 2D6 et le polymorphisme situé au niveau du locus HPA (hydrocarbures polycycliques aromatiques). Le locus HPA code pour un récepteur cytosolique qui est impliqué dans la régulation des gènes des cytochromes P-450 1A1 et 1A2. Les individus qui ont un niveau élevé d'induction du cytochrome P-450 1A1 présentent un risque élevé de cancer du poumon s'ils sont fumeurs. Dans le système d'acétylation, les acétylateurs lents exposés à la teinture (dérivés de l'aniline) ont un risque plus élevé de cancer de la vessie. Ce même phénotype entraîne une augmentation du risque de développement de lupus érythémateux, de neurotoxicité secondaire à l'administration de médicaments et de maladies hépatiques [15]. Des études plus récentes ont montré que l'acétylateur rapide peut développer plus facilement un diabète de type I et/ou un cancer colorectal [15]. Concernant le métabolisme de la débrisoquine qui permet d'explorer l'activité du cytochrome P-450 2D6, un métabolisme rapide expose à un risque élevé de cancer du poumon chez les fumeurs et de cancer de l'appareil digestif [15].
Un autre exemple de prédisposition génétique concerne les enzymes glutathion-S-transférases (GST). Ces enzymes ont pour rôle de conjuguer au glutathion de nombreux xénobiotiques électrophiles, comme les époxydes et les hydroperoxydes organiques (carcinogènes) en détoxifiant ces composés [16]. Plusieurs isoenzymes de la GST, comme celles de la classe -µ, peuvent être considérées comme protéines de stockage, en raison de leur capacité à se lier de façon non covalente à des composés endogènes ou exogènes. Warholm et al. [17] ont étudié l'expression de cette enzyme sur des prélèvements humains de foie et ont montré que la GST-µ était exprimée dans la moitié des prélèvements. Seidegard et al. [18] ont confirmé ce polymorphisme de la GST-µ en montrant qu'il était possible de classer les individus en 2 groupes : activité GST-µ élevée et activité GST-µ faible, la transmission d'une activité GST-µ faible s'effectuant selon un mode autosomique récessif [18]. L'ADN complémentaire (ADNc) codant pour la GST-µ (1p31) a été cloné par Dejong et al. [19] et Seidegard et al. [20]. Par technique ACP (amplification en chaîne par la polymérase), des fragments d'ADN correspondant à ce gène ont été amplifiés et analysés chez des individus avec une activité GST-µ élevée ou faible [21]. L'analyse des fragments de restriction, après digestion avec l'enzyme EcoRI, a montré la présence d'un fragment de 7,2 kb chez 49 individus sur 106 étudiés. Une corrélation phénogénotypique significative a été mise en évidence et a montré la présence de ce fragment quand l'activité GST-µ était élevée et l'absence du fragment quand l'activité était faible.
Seidegard et al. [22] ont été les premiers à étudier l'activité GST-µ chez des patients atteints d'un cancer du poumon avec une longue histoire de consommation tabagique. Ces auteurs ont observé une augmentation significative du nombre de personnes ayant une activité GST-µ faible dans le groupe de patients atteints d'un cancer du poumon, par comparaison à un groupe contrôle. Une tendance similaire a été observée dans une autre étude effectuée à Berlin [23]. Ces résultats suggèrent que les individus avec une activité GST-µ faible ont un risque plus élevé de cancer du poumon par rapport aux personnes avec une activité GST-µ élevée. Hirvonen et al. [24] ont étudié la relation entre l'émergence d'un mésothéliome pleural et le génotype GST-µ chez des patients exposés à l'amiante. Ce travail a montré de façon évidente une corrélation entre la présence d'un génotype GST-µ de type GST-µ « faible » et l'émergence d'un mésothéliome.
Efficacité et/ou toxicité de la chimiothérapie
* Les oxazaphosphorines. Les oxazaphosphorines, comme l'ifosfamide ou le cyclophosphamide, sont des prodrogues qui nécessitent une activation métabolique afin de libérer des composés ayant une activité alkylante. Il s'agit d'un métabolisme complexe faisant intervenir différentes étapes, mais la première réaction d'hydroxylation est catabolisée par le cytochrome P-450 2C [25], dont le polymorphisme génétique a été démontré [26]. Une autre enzyme impliquée dans le métabolisme de ces molécules est l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et plus particulièrement l'ALDH1 qui conduit à une inactivation de ces agents alkylants. Cette réaction d'inactivation a été corrélée à la résistance aux oxazaphosphorines dans des lignées cellulaires in vitro [27]. Le rôle de l'ALDH1 in vivo dans la résistance à ces composés n'a pas été encore démontré, mais il apparaît que l'inactivation systémique de certains intermédiaires réactifs varie de façon importante suivant les individus. Cela pourrait avoir des implications sur la toxicité et l'efficacité de ces médicaments. Ainsi, il a été identifié une population de carboxylateurs lents du cyclophosphamide, dans une étude portant sur l'excrétion urinaire des métabolites de cette molécule [28]. Dans cette étude, approximativement un tiers des individus excrétaient moins de 0,3 % de la dose administrée, sous forme de métabolites carboxyliques, alors que les carboxylateurs rapides en excrétaient de 0,8 à 13,6 % de la dose. Le polymorphisme génétique de l'enzyme ALDH1 a été démontré [29], et la déficience dans cette enzyme peut être diagnostiquée par étude génotypique [30]. Une autre molécule de la même classe, l'ifosfamide, a été étudiée en utilisant les mêmes techniques. Pour cette molécule, aucune différence phénotypique dans l'excrétion des métabolites carboxyliques n'a été identifiée chez des patients traités pour un carcinome du poumon non à petites cellules [31] ou pour un adénocarcinome mammaire [32].
* L'amonafide. L'amonafide est un agent intercalant qui présente une activité antitumorale dans les cancers de la prostate et du sein. Une étude de phase I de l'amonafide, chez des patients présentant une leucémie aiguë, a mis en évidence des variations importantes dans les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule [33]. L'amonafide forme un métabolite actif, le N-acétyl-amonafide, dans une réaction catalysée par l'enzyme N-acétyltransférase 2 (NAT2) [34]. Cette enzyme NAT2 présente un important polymorphisme qui a été bien décrit, avec 5 à 90 % des individus (en fonction des groupes ethniques) qui ont un phénotype d'acétylateur lent. Dans la population caucasienne, le pourcentage de métaboliseurs lents se situe entre 40 % et 60 % [35]. Ainsi, il apparaît que chaque groupe de patients peut présenter un polymorphisme pour le métabolisme de l'amonafide.
* L'irinotécan (CPT-11). Le CPT-11 est utilisé dans le traitement des carcinomes coliques. Cette molécule a pour propriété d'être un inhibiteur de la topoisomérase I ; il s'agit d'une prodrogue qui est secondairement transformée en SN-38 par l'enzyme carboxylestérase. Ce premier métabolite, le SN-38, est le composé actif qui permet d'exercer l'action antitumorale [36]. Ensuite, une réaction d'élimination fait intervenir l'UDP-glucuronosyltransférase qui permet la transformation en SN-38-glucuronide. Gupta et al. [37] ont montré que le principal effet secondaire (diarrhée) était corrélé à l'activité de cette dernière enzyme et ont déjà établi l'existence d'un phénomène pharmacogénétique pour cette molécule, dont la première apparition en phase I a débuté depuis 5 ans. L'étude de phase I conduite par Abigerges et al. [38] met en évidence une DMT (dose maximale tolérable) et un effet secondaire majeur qui diffèrent avec les études de Taguchi et al. [39], de Negoro et al. [40] et de Rowinsky et al. [41]. Pour expliquer ces différences, les auteurs évoquent les différentes modalités de prescription mais aussi un possible polymorphisme pharmacogénétique responsable des variations dans le métabolisme du CPT-11 en fonction des individus.
* L'azathioprine, la 6-mercaptopurine et la 6-thioguanine. Le cas de la 6-mercaptopurine (6-MP) demeure intéressant dans le domaine de la pharmacogénétique des composés anticancéreux, car les mécanismes moléculaires ont été partiellement définis par Krynetski et al. [42]. Cette molécule est plus particulièrement utilisée dans le traitement d'entretien des leucémies aiguës lymphoblastiques. La 6-MP est inactivée par S-méthylation, une réaction catalysée par l'enzyme thiopurine méthyltransférase (TPMT). Le polymorphisme génétique concernant cette enzyme TPMT a permis de classer les patients en 3 groupes [43, 44]. La déficience en TPMT profonde définie comme homozygote en raison de l'activité de l'enzyme est rare (1/300), mais les conséquences cliniques peuvent en être graves, exposant le malade à un risque toxique majeur vis-à-vis de la 6-MP et du composé immunosuppresseur analogue qu'est l'azathioprine [43, 45]. La deuxième population présente un niveau d'activité TPMT intermédiaire, et est définie au point de vue phénotypique comme hétérozygote. Cette population montre une variation importante dans l'activité TPMT qui peut être reliée directement à la formation du composé nucléotidique 6-thioguanine (6-TGN) [46] et à la réponse thérapeutique [43]. Enfin, les patients qui présentent une activité TPMT élevée peuvent être résistants à la 6-MP et tolérer des doses élevées de cette molécule, sans effets toxiques myélosuppresseurs [43].
Des progrès dans l'élucidation du polymorphisme de l'enzyme TPMT ont pu être réalisés grâce à la purification de cette enzyme et secondairement grâce au clonage de l'ADNc codant pour cette enzyme [47]. Krynetski et al. [42] ont mis en évidence une mutation dans l'ADNc codant pour la TPMT, isolé à partir d'un patient présentant une déficience dans cette enzyme. L'étude de la séquence nucléotidique de l'ADNc du patient déficitaire a permis de mettre en évidence une mutation ponctuelle G * C qui entraîne l'apparition d'une substitution dans la séquence acide aminé de type Ala * Pro. Afin d'évaluer l'importance de cette mutation dans la déficience en TPMT, ces auteurs ont utilisé un système d'expression (levure) qui a permis de montrer que cette mutation diminuait d'un facteur 100 l'activité de cette enzyme. La transmission héréditaire de cette mutation a été confirmée par la mise en évidence de la même substitution nucléotidique dans l'ADN génomique de la mère du patient. Ce travail présente une avancée importante dans l'explication de la déficience en TPMT et participera probablement à l'élaboration de tests moléculaires permettant de déterminer, avant administration de 6-mercaptopurine ou d'azathioprine, si le patient est déficitaire dans l'enzyme TPMT.
* Le 5 fluoro-uracile (5FU). Cet antimétabolite a été introduit en clinique il y a un peu plus de 30 ans ; les paramètres cliniques et biologiques de cet agent ont été extensivement étudiés. Ainsi, les connaissances sur les variations pharmacogénétiques du 5FU sont avancées par rapport à d'autres molécules anticancéreuses. Le 5 fluoro-uracile est un agent cytotoxique couramment utilisé dans des pathologies néoplasiques concernant le sein, le côlon et les voies aérodigestives supérieures. Le rôle important de l'enzyme DPD (dihydropyrimidine déshydrogénase) au cours de l'administration de 5FU a été démontré dans plusieurs études. Il a été montré que la déficience en DPD prédisposait les patients à une toxicité importante parfois mortelle, après administration de 5FU. La DPD est la première enzyme intervenant dans le catabolisme des bases pyrimidiques et donc du 5FU. Cette enzyme catalyse la réaction suivante : pyrimidine + NADPH * dihydropyrimidine + NADP+. Cette transformation des bases pyrimidiques est la première réaction dans les 3 étapes qui conduisent à la conversion de l'uracile en ß-alanine ; cette voie métabolique est la seule qui conduise à la synthèse de ß-alanine chez les mammifères [48]. Compte tenu de l'importance de cette enzyme, de nombreuses études ont eu pour but de potentialiser l'activité du 5 fluoro-uracile par l'adjonction d'inhibiteurs de la DPD [49]. De nouvelles molécules comme l'éthynyluracile augmentent l'activité cytotoxique quand elles sont coadministrées à de faibles doses de 5FU. Sur la base de ces premiers résultats précliniques, l'éthynyluracile est en cours d'évaluation dans des études cliniques de faisabilité.
En 1988, Diasio et al. [50] ont décrit le cas d'un patient qui avait présenté une toxicité considérée comme sévère après administration de 5FU. L'étude de l'activité DPD dans les cellules mononucléaires chez le patient et les membres de la famille démontrait une déficience dans l'enzyme DPD ; cette déficience se transmettait selon un mode autosomique récessif (figure 1) [50]. Cette dernière donnée fut établie sur la mesure de l'activité DPD et non pas au niveau moléculaire (ADN), car le gène codant pour la DPD ne fut cloné que plus tard. Depuis ces premiers cas, il a été rapporté les cas de 12 patients supplémentaires présentant une déficience en DPD. En raison des résultats de l'activité DPD, il a été suggéré que les patients classés comme profondément déficitaires étaient homozygotes et que les autres patients classés comme déficitaires simples étaient hétérozygotes pour le déficit [51].
Afin d'évaluer la distribution de l'activité DPD et de déterminer si un polymorphisme génétique pour l'enzyme DPD existe, plusieurs études ont été entreprises dans la population générale et chez les patients atteints de cancer. Une étude récente portant sur 124 sujets sains (45 % d'hommes et 55 % de femmes) démontrait une distribution de l'activité DPD, mesurée sur les cellules mononucléaires, suivant une loi normale, avec des variations pouvant aller jusqu'à un facteur 4 [52]. Les différences dans l'activité DPD n'étaient pas dues au sexe, à l'âge ou à l'origine ethnique. Plus récemment, Lu et al. [53] reportaient les résultats préliminaires portant sur une population de 151 femmes atteintes d'un adénocarcinome mammaire. La distribution de l'activité DPD était similaire à la population générale. Par contre, l'activité moyenne DPD était significativement inférieure à celle observée dans la population générale. Sur ces
151 patientes, 3 (2 %) avaient une activité DPD qui était inférieure à la limite définie par l'intervalle où l'on peut classer 95 % de la population. Ces dernières patientes étaient donc classées comme déficitaires en DPD.
Il existe un autre type de déficience en DPD décrit par Brocksted et al. [54] et qui atteint de jeunes enfants. Dans ce cas, la déficience en DPD s'intègre dans un syndrome appelé « thymine-uracilurie », caractérisé par des malformations morphologiques mineures et des symptômes neurologiques [55]. L'activité DPD de ces enfants est pratiquement nulle ; au point de vue biochimique, il est possible de noter une accumulation de l'uracile et de la thymine dans les urines [55, 56], dans le sang [56] et dans le liquide céphalo-rachidien [56]. Dans quelques cas, le 5-hydroxyméthyluracile, un métabolite de la thymine, est aussi excrété [57].
À l'aide de la séquence en acides aminés des peptides dérivés de la protéine DPD purifiée à partir du bovin, Albin et al. [58] ont été en mesure de cloner l'ADNc codant pour la DPD dans cette même espèce et secondairement de cloner l'ADNc codant pour la DPD à partir des lymphocytes humains [59]. Une publication récente de Yokota et al. [60] a fait état du clonage de l'ADNc codant pour la DPD isolé à partir du foie de porc et du foie humain. Albin et al. [61] ont mis en évidence une mutation dans l'ADNc codant pour la DPD, isolé à partir des lymphocytes d'un patient présentant une déficience dans cette enzyme. L'étude génotypique de cette mutation située en position 2894 (numérotation selon la séquence soumise à GenBank, numéro d'accès : U20938) a permis de démontrer que la patiente était homozygote, alors que les parents étaient hétérozygotes pour cette variation nucléotidique. Une identité phénogénotypique a donc été obtenue pour cette mutation, ce qui renforce l'intérêt de l'étude de cette variation nucléotidique. La fréquence de cette mutation a été étudiée chez 25 individus présentant une activité DPD normale et n'a pas été identifiée dans cette population. Meinsma et al. [62] ont décrit également une mutation (délétion de 165 paires de bases) chez les enfants atteints du syndrome thymine-uracilurie. Cette même délétion apparaît pour ces auteurs comme responsable du syndrome thymine-uracilurie mais aussi de la déficience en DPD classiquement identifiée chez les patients recevant du 5FU [63]. Ce dernier point reste troublant car ces 2 types de déficience en DPD diffèrent sur bien des éléments cliniques et biologiques.
Ces travaux représentent la base de l'étude du polymorphisme génétique impliquant l'enzyme DPD et le 5FU ; ces données sont indispensables à l'élucidation de ce polymorphisme génétique mais ne permettent pas d'en définir la cause moléculaire exacte. La complexité de cette thématique, associée aux différentes voies de recherche qu'il convient maintenant d'explorer, permet de mesurer la difficulté des études concernant la pharmacogénétique. Ces travaux sont indispensables et devraient autoriser à l'avenir une meilleure utilisation de cette molécule grâce à la mise au point de tests génotypiques visant à prévenir ou à réduire la toxicité de ce médicament.
Métabolisme intratumoral
Comme la définition d'une variation pharmacogénétique peut inclure les variations génétiques entre l'hôte et le tissu tumoral, ces mêmes variations peuvent être utilisées comme cible potentielle pour améliorer la sélectivité des agents chimiothérapiques. Une telle sélectivité a déjà été obtenue pour des agents qui agissent spécifiquement sur des cellules tumorales exprimant une protéine cible altérée par rapport à la cellule normale. Des cibles comme les récepteurs hormonaux, les antigènes de surface et les enzymes impliquées dans la réplication cellulaire sont surexprimées dans certaines tumeurs et permettent d'obtenir un certain degré de sélectivité. Par contre, la cytotoxicité sélective due à des différences dans le métabolisme des médicaments entre l'hôte et le tissu tumoral est encore assez peu exploitée. Si des différences dans le métabolisme des médicaments peuvent être identifiées entre l'hôte et le tissu tumoral, elles donneront une cible supplémentaire utile afin d'obtenir une meilleure sélectivité antitumorale [64].
Des différences entre l'hôte et le tissu tumoral peuvent être innées ou acquises pendant la chimiothérapie en raison de la pression sélective induite par les molécules cytotoxiques administrées. Des changements dans le métabolisme des molécules ou dans le transport ont été associés à l'apparition de résistance vis-à-vis des agents cytotoxiques. Ces changements qui ont pour conséquence d'inactiver une molécule pour laquelle certaines cellules sont résistantes peuvent être exploités pour détourner cette résistance. Une approche possible pour exploiter les différences dans le métabolisme des médicaments entre cellules malignes et bénignes est donnée lors de l'étude du niveau d'expression du CYP 1A dans des cellules d'adénocarcinomes mammaires et des cellules non tumorales entourant la tumeur [65]. Ces résultats permettent d'envisager de donner des agents activés par le CYP 1A comme traitement de ces tumeurs et ainsi d'augmenter la sélectivité antitumorale.
L'activité GST-µ a été étudiée dans un nombre important de tissus tumoraux, comme le sein [66], le côlon [67], les voies aérodigestives supérieures [68], le pancréas [69], les lymphomes [70], les leucémies aiguës lymphoblastiques [71] et le poumon [72]. Au vu du nombre important d'études et de la variabilité de l'expression de la GST-µ en fonction du tissu, du type de tumeur, de la taille de la tumeur [73], il apparaît difficile d'effectuer une synthèse globale de ces différents travaux. Les éléments apportés par ces études sont que le polymorphisme de la GST-µ a été mis en évidence dans l'ensemble de ces tissus tumoraux et que l'activité GST-µ est parfois augmentée dans le tissu tumoral (sein, poumon et tumeur ORL) par comparaison au tissu péritumoral, mais cette notion diffère avec le type de tumeur étudiée. Hall et al. [74] ont étudié la relation entre la GST-µ et la réponse à la chimiothérapie. Ces auteurs ont mis en évidence une relation entre l'activité GST-µ mesurée dans les cellules blastiques et la survie sans rechute chez des enfants traités pour une leucémie aiguë lymphoblastique. De façon similaire, Herbergs et al. [75] ont étudié le système glutathion dans les érythrocytes de patients traités pour des carcinomes ORL et ont mis en évidence une corrélation entre ce système et la réponse à la chimiothérapie.
La relation entre l'activité DPD mesurée dans les cellules mononucléaires et la clairance du 5FU a été étudiée par Fleming et al. [76] ; ces derniers ont montré une corrélation linéaire entre ces 2 paramètres. Ces données tendent à montrer que l'enzyme DPD peut jouer un rôle déterminant dans la réponse clinique observée après administration de 5FU. Beck et al. [77] ont montré, sur des lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l'activité TS (thymidylate synthétase) et DPD ont été mesurées et comparées à la cytotoxicité du 5FU, que l'activité DPD était significativement corrélée à la sensibilité au 5FU : plus l'activité DPD était faible et plus les cellules étaient sensibles à la molécule. In vivo, une étude récente a montré une relation entre l'activité DPD intratumorale et la réponse à la chimiothérapie chez des patients traités pour des carcinomes de la sphère ORL [78].
Remerciements
Nous tenons à remercier l'Association pour la recherche sur le cancer (ARC) pour sa participation financière qui nous a permis de continuer cette thématique de recherche.
CONCLUSION
Les nouvelles techniques de biochimie et de biologie moléculaire permettent de déterminer les mécanismes d'action d'une molécule et les bases moléculaires des facteurs (individu et tumeur) qui influencent son action. À ce jour, les 2 exemples qui permettent une application du concept pharmacogénétique dans la chimiothérapie anticancéreuse ont été décrits pour la 6-mercaptopurine et le 5 fluoro-uracile. Ces résultats ont pu être obtenus grâce à une étude extensive du métabolisme de ces médicaments et à la mise en évidence d'enzymes clés intervenant dans le métabolisme de ces molécules. Secondairement, des corrélations entre l'activité de ces enzymes clés (DPD, TPMT) et les effets cliniques de la molécule ont été décrites. La mise en évidence des gènes responsables de la synthèse de ces enzymes a permis de définir ces concepts pharmacogénétiques au niveau génotypique et d'ainsi pouvoir envisager, à court terme, la détermination génotypique et préthérapeutique du profil toxique de la molécule administrée. La pharmacogénétique apparaît être un élément important dans la variabilité de la toxicité ou de la réponse antitumorale vis-à-vis d'agents chimiothérapiques. La détermination complète des bases moléculaires impliquées dans ces variations permettra certainement d'améliorer nos connaissances sur la pharmacologie de la tumeur et de l'individu et ainsi de contribuer à l'optimisation de la prescription anticancéreuse.
Il est probable qu'au cours du xxie siècle nous verrons disparaître en oncohématologie le dogme de la prescription chimiothérapique en fonction de la surface corporelle, au bénéfice d'une prescription plus personnalisée adaptée à chaque individu [79]. L'objectif de cette prescription est d'obtenir la concentration optimale d'une molécule pour chaque patient. Une telle approche pourra aussi être utilisée afin de tenir compte des variations pharmacogénétiques et/ou de l'importance de l'activation métabolique. Elle nécessitera une bonne compréhension des relations entre la molécule mère, les différents métabolites et une évaluation précise des interactions entre l'hôte et la tumeur. L'acquisition de ces informations est particulièrement difficile, étant donné le nombre important d'individus nécessaires pour caractériser un polymorphisme génétique, et aussi en raison de l'extrême variabilité qui caractérise le tissu tumoral. Des techniques, comme celles qui consiste à prélever un échantillon de sang à un temps considéré comme optimal, ou à évaluer les effets cytotoxiques à des temps intermédiaires, peuvent permettre de valider ces données sur une grande population. Malheureusement, ces données doivent être interprétées avec précaution, car la complexité des modèles utilisés et la difficulté à mesurer le composé chimique ou la réponse pharmacologique appropriée peuvent invalider toute tentative d'individualisation.
Résumé : Pour estimer la valeur pronostique de l'analyse cytométrique en flux, 61 cas de cancers bronchiques épidermoïdes opérés ont été étudiés en termes de contenu en acide désoxyribonucléique (ADN) et de pourcentage de cellules en phase de synthèse d'ADN (% S). Ces paramètres ont été déterminés sur des prélèvements chirurgicaux frais. Le % S a été obtenu dans 25 cas. L'index d'ADN (ID) et le % S ont été comparés à la survie et aux caractéristiques clinicopathologiques habituelles pour la prédiction de la survie. Le contenu en ADN classé en ADN-diploïde et ADN-aneuploïde n'est pas un facteur pronostique de la survie. Un ID supérieur à 2 semble prédictif mais nécessite confirmation. Le % S et la multiploïdie ne sont pas des facteurs prédictifs de la survie.
Mots-clés : cytométrie en flux, cancer bronchique épidermoïde, pronostic, survie.
Illustrations
ARTICLE
L'étude des variations génétiquement contrôlées de la réponse à un médicament, classiquement appelée « pharmacogénétique », est une notion relativement nouvelle. En 1957, Motulsky [1] montra que certains effets secondaires des médicaments pouvaient être causés par des variations enzymatiques génétiquement déterminées. En 1959, Vogel [2] proposa le premier le terme de pharmacogénétique et, en 1962, Kalow [3] écrivit la première revue sur ce sujet. Dans les 30 dernières années, plus de 100 exemples de réponse exagérée à un médicament, d'apparition de nouveaux effets secondaires ou d'absence d'efficacité d'une molécule donnée à des doses conventionnelles en relation avec des traits héréditaires individuels ont été observés. Plus récemment, des polymorphismes génétiques communs en rapport avec le métabolisme d'un médicament, comme le polymorphisme de la débrisoquine/spartéine, le polymorphisme de la méphénytoïne et les polymorphismes faisant intervenir une réaction d'acétylation, ont été étudiés extensivement, probablement parce qu'ils affectent le métabolisme de médicaments fréquemment utilisés en médecine et concernent un nombre important de patients [4, 5].
Jusqu'à des années récentes, les variations génétiques dans la réponse à un médicament étaient presque exclusivement déterminées par des méthodes classiques qui consistaient à étudier les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques à l'échelle de l'individu, de la famille, puis d'une population. La situation a quelque peu changé ces dernières années grâce aux progrès effectués dans la compréhension des structures et des fonctions des gènes humains. L'utilisation des techniques de recombinaison de l'ADN, pour l'étude de ces gènes et de leurs produits, a été une innovation majeure en médecine et en génétique humaine, et a permis une approche plus fondamentale du concept pharmacogénétique. L'implication la plus importante de ces techniques d'approche de l'ADN inclut l'élucidation et le séquençage de la structure des gènes impliqués, la définition des mutations qui entraînent l'absence ou la diminution des protéines participant à l'action d'un médicament et le développement de tests génétiques pour détecter ces mutations. Le tableau I montre les principaux mécanismes mis en jeu dans les déficiences quantitatives ou qualitatives d'une enzyme intervenant dans le métabolisme d'un médicament.
Notion de polymorphisme génétique
Le concept de polymorphisme génétique provient de l'observation que de nombreux traits phénotypiques comme le groupe sanguin, les groupes d'histocompatibilité (système HLA) apparaissent dans la population avec une fréquence qui ne peut être expliquée seulement par l'apparition de mutations. Plus de 20 % des protéines, dans chaque être humain, diffèrent dans leurs propriétés électrophorétiques par rapport à la protéine de référence [6]. La notion de polymorphisme ne peut se détacher de la notion d'évolution. Ainsi, le polymorphisme génétique peut expliquer qu'une modification de l'environnement (exposition à des produits chimiques ou autres) peut sélectionner un changement dans la population. Ces polymorphismes sont dus à des variants alléliques et sont caractérisés par une fréquence élevée d'hétérozygotes dans la population. Il est difficile de savoir par quel mécanisme une mutation peut être maintenue à un haut niveau de fréquence dans la population. Deux mécanismes peuvent être envisagés : soit un procédé de sélection naturelle qui favorise l'émergence d'une mutation, soit la présence de mutations « neutres » n'interférant que peu ou pas du tout avec la fonction de la protéine [7]. La fréquence des polymorphismes génétiques varie considérablement avec les régions du génome étudiées. De façon générale, plus la fonction du gène considérée est importante plus la fréquence des variations géniques est faible [8]. Il a été observé que les polymorphismes génétiques étaient préférentiellement identifiés pour des fonctions en relation avec l'environnement, comme le système immunitaire, les enzymes impliquées dans le métabolisme des médicaments et les processus d'inactivation d'agents chimiques de l'environnement. Par contraste, le multiallélisme est moins fréquent pour des gènes dont les fonctions sont en relation avec les processus de régulation ou de contrôle cellulaire [9]. Il est habituellement admis qu'un phénotype présent à une fréquence supérieure à 1 ou 2 % doit être considéré comme un polymorphisme ; cette notion est quelque peu arbitraire et ne tient pas compte du caractère homozygote ou hétérozygote du variant ainsi identifié.
L'analyse de l'ADN génomique par les techniques de Southern blot ou de PTFR (polymorphisme de taille des fragments de restriction) permet de révéler des polymorphismes au niveau de l'ADN qui reflètent directement le génotype, mais qui peuvent ne pas avoir d'influence sur le phénotype. Il apparaît que les définitions futures concernant les polymorphismes devront être aussi basées sur la fréquence de l'allèle modifié au niveau de l'ADN génomique. Beaucoup de ces polymorphismes identifiés au niveau de l'ADN (génotype) ne sont pas cliniquement importants car ils ne modifient pas la quantité ou l'activité de la protéine [9].
Interprétation d'un phénomène pharmacogénétique
En raison de la variabilité de la réponse clinique vis-à-vis d'une molécule chimiothérapique, un phénomène pharmacogénétique ne pourra être interprété qu'après étude préalable des paramètres suivants : (1) tout d'abord, il est nécessaire d'interpréter les données pharmacocinétiques de la molécule et de ses métabolites. La corrélation des concentrations plasmatiques de la molécule ou de ses métabolites avec les effets biologiques et cliniques est la première étape dans l'élucidation des mécanismes impliqués dans les variations cliniques observées après administration de la molécule. Ces variations peuvent être expliquées par des modifications de certains paramètres cliniques comme la fonction rénale, la fonction hépatique et l'état nutritionnel. La dose du médicament peut alors être adaptée à la fonction rénale, comme dans le cas d'un dérivé du platine [10, 11] ; (2) la deuxième étape consiste à identifier certaines enzymes clés intervenant dans le métabolisme d'un médicament. Si une base pharmacogénétique est identifiée pour un médicament, après comparaison des données métaboliques et cliniques, le (ou les) enzyme(s) responsable(s) de ce métabolisme doi(ven)t être identifiée(s). Cela peut être réalisé grâce à des études in vitro à l'aide de systèmes d'expression qui permettent d'identifier les enzymes responsables d'une action spécifique [12]. La combinaison de ces systèmes avec des inhibiteurs et/ou des inducteurs devrait permettre l'identification des enzymes prépondérantes dans la biotransformation du médicament. Une fois que l'enzyme est identifiée et purifiée, l'ADNc et/ou le gène codant pour cette enzyme peuvent être isolés, ce qui permet de rechercher des mutations pouvant expliquer les variations dans l'activité de cette enzyme.
Applications de la pharmacogénétique en oncohématologie
Prédisposition génétique au risque de cancer
Il est possible de définir en pharmacogénétique 2 types de réponses à un médicament, une réponse de type aigu et une réponse de type chronique. Habituellement, le phénotype qui induit une réponse aiguë n'est pas celui qui induit une réponse chronique. Le risque de cancer est considéré comme une réponse pharmacogénétique de type chronique. Ce risque de cancer secondaire peut être très variable suivant les individus, cette notion de risque repose sur des différences d'expression de gènes particuliers intervenant dans le niveau de régulation des enzymes. Un médicament particulier ou une substance toxique peuvent donner un risque de cancer chez un individu mais aussi être inoffensifs chez un autre individu [13].
Cette notion de risque génétique de cancer en rapport avec les enzymes de biotransformation peut être illustrée à l'aide de quelques exemples. Des différences génétiques dans certaines enzymes comme la N-acétyltransférase 2 (NAT 2) et le cytochrome P-450 (CYP) 2D6 peuvent exposer les individus à un risque plus élevé de cancer [14]. Dans une revue sur le sujet, Nebert [15] insiste sur 3 polymorphismes pharmacogénétiques : le système d'acétylation, le système débrisoquine qui explore le cytochrome P-450 2D6 et le polymorphisme situé au niveau du locus HPA (hydrocarbures polycycliques aromatiques). Le locus HPA code pour un récepteur cytosolique qui est impliqué dans la régulation des gènes des cytochromes P-450 1A1 et 1A2. Les individus qui ont un niveau élevé d'induction du cytochrome P-450 1A1 présentent un risque élevé de cancer du poumon s'ils sont fumeurs. Dans le système d'acétylation, les acétylateurs lents exposés à la teinture (dérivés de l'aniline) ont un risque plus élevé de cancer de la vessie. Ce même phénotype entraîne une augmentation du risque de développement de lupus érythémateux, de neurotoxicité secondaire à l'administration de médicaments et de maladies hépatiques [15]. Des études plus récentes ont montré que l'acétylateur rapide peut développer plus facilement un diabète de type I et/ou un cancer colorectal [15]. Concernant le métabolisme de la débrisoquine qui permet d'explorer l'activité du cytochrome P-450 2D6, un métabolisme rapide expose à un risque élevé de cancer du poumon chez les fumeurs et de cancer de l'appareil digestif [15].
Un autre exemple de prédisposition génétique concerne les enzymes glutathion-S-transférases (GST). Ces enzymes ont pour rôle de conjuguer au glutathion de nombreux xénobiotiques électrophiles, comme les époxydes et les hydroperoxydes organiques (carcinogènes) en détoxifiant ces composés [16]. Plusieurs isoenzymes de la GST, comme celles de la classe -µ, peuvent être considérées comme protéines de stockage, en raison de leur capacité à se lier de façon non covalente à des composés endogènes ou exogènes. Warholm et al. [17] ont étudié l'expression de cette enzyme sur des prélèvements humains de foie et ont montré que la GST-µ était exprimée dans la moitié des prélèvements. Seidegard et al. [18] ont confirmé ce polymorphisme de la GST-µ en montrant qu'il était possible de classer les individus en 2 groupes : activité GST-µ élevée et activité GST-µ faible, la transmission d'une activité GST-µ faible s'effectuant selon un mode autosomique récessif [18]. L'ADN complémentaire (ADNc) codant pour la GST-µ (1p31) a été cloné par Dejong et al. [19] et Seidegard et al. [20]. Par technique ACP (amplification en chaîne par la polymérase), des fragments d'ADN correspondant à ce gène ont été amplifiés et analysés chez des individus avec une activité GST-µ élevée ou faible [21]. L'analyse des fragments de restriction, après digestion avec l'enzyme EcoRI, a montré la présence d'un fragment de 7,2 kb chez 49 individus sur 106 étudiés. Une corrélation phénogénotypique significative a été mise en évidence et a montré la présence de ce fragment quand l'activité GST-µ était élevée et l'absence du fragment quand l'activité était faible.
Seidegard et al. [22] ont été les premiers à étudier l'activité GST-µ chez des patients atteints d'un cancer du poumon avec une longue histoire de consommation tabagique. Ces auteurs ont observé une augmentation significative du nombre de personnes ayant une activité GST-µ faible dans le groupe de patients atteints d'un cancer du poumon, par comparaison à un groupe contrôle. Une tendance similaire a été observée dans une autre étude effectuée à Berlin [23]. Ces résultats suggèrent que les individus avec une activité GST-µ faible ont un risque plus élevé de cancer du poumon par rapport aux personnes avec une activité GST-µ élevée. Hirvonen et al. [24] ont étudié la relation entre l'émergence d'un mésothéliome pleural et le génotype GST-µ chez des patients exposés à l'amiante. Ce travail a montré de façon évidente une corrélation entre la présence d'un génotype GST-µ de type GST-µ « faible » et l'émergence d'un mésothéliome.
Efficacité et/ou toxicité de la chimiothérapie
* Les oxazaphosphorines. Les oxazaphosphorines, comme l'ifosfamide ou le cyclophosphamide, sont des prodrogues qui nécessitent une activation métabolique afin de libérer des composés ayant une activité alkylante. Il s'agit d'un métabolisme complexe faisant intervenir différentes étapes, mais la première réaction d'hydroxylation est catabolisée par le cytochrome P-450 2C [25], dont le polymorphisme génétique a été démontré [26]. Une autre enzyme impliquée dans le métabolisme de ces molécules est l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et plus particulièrement l'ALDH1 qui conduit à une inactivation de ces agents alkylants. Cette réaction d'inactivation a été corrélée à la résistance aux oxazaphosphorines dans des lignées cellulaires in vitro [27]. Le rôle de l'ALDH1 in vivo dans la résistance à ces composés n'a pas été encore démontré, mais il apparaît que l'inactivation systémique de certains intermédiaires réactifs varie de façon importante suivant les individus. Cela pourrait avoir des implications sur la toxicité et l'efficacité de ces médicaments. Ainsi, il a été identifié une population de carboxylateurs lents du cyclophosphamide, dans une étude portant sur l'excrétion urinaire des métabolites de cette molécule [28]. Dans cette étude, approximativement un tiers des individus excrétaient moins de 0,3 % de la dose administrée, sous forme de métabolites carboxyliques, alors que les carboxylateurs rapides en excrétaient de 0,8 à 13,6 % de la dose. Le polymorphisme génétique de l'enzyme ALDH1 a été démontré [29], et la déficience dans cette enzyme peut être diagnostiquée par étude génotypique [30]. Une autre molécule de la même classe, l'ifosfamide, a été étudiée en utilisant les mêmes techniques. Pour cette molécule, aucune différence phénotypique dans l'excrétion des métabolites carboxyliques n'a été identifiée chez des patients traités pour un carcinome du poumon non à petites cellules [31] ou pour un adénocarcinome mammaire [32].
* L'amonafide. L'amonafide est un agent intercalant qui présente une activité antitumorale dans les cancers de la prostate et du sein. Une étude de phase I de l'amonafide, chez des patients présentant une leucémie aiguë, a mis en évidence des variations importantes dans les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule [33]. L'amonafide forme un métabolite actif, le N-acétyl-amonafide, dans une réaction catalysée par l'enzyme N-acétyltransférase 2 (NAT2) [34]. Cette enzyme NAT2 présente un important polymorphisme qui a été bien décrit, avec 5 à 90 % des individus (en fonction des groupes ethniques) qui ont un phénotype d'acétylateur lent. Dans la population caucasienne, le pourcentage de métaboliseurs lents se situe entre 40 % et 60 % [35]. Ainsi, il apparaît que chaque groupe de patients peut présenter un polymorphisme pour le métabolisme de l'amonafide.
* L'irinotécan (CPT-11). Le CPT-11 est utilisé dans le traitement des carcinomes coliques. Cette molécule a pour propriété d'être un inhibiteur de la topoisomérase I ; il s'agit d'une prodrogue qui est secondairement transformée en SN-38 par l'enzyme carboxylestérase. Ce premier métabolite, le SN-38, est le composé actif qui permet d'exercer l'action antitumorale [36]. Ensuite, une réaction d'élimination fait intervenir l'UDP-glucuronosyltransférase qui permet la transformation en SN-38-glucuronide. Gupta et al. [37] ont montré que le principal effet secondaire (diarrhée) était corrélé à l'activité de cette dernière enzyme et ont déjà établi l'existence d'un phénomène pharmacogénétique pour cette molécule, dont la première apparition en phase I a débuté depuis 5 ans. L'étude de phase I conduite par Abigerges et al. [38] met en évidence une DMT (dose maximale tolérable) et un effet secondaire majeur qui diffèrent avec les études de Taguchi et al. [39], de Negoro et al. [40] et de Rowinsky et al. [41]. Pour expliquer ces différences, les auteurs évoquent les différentes modalités de prescription mais aussi un possible polymorphisme pharmacogénétique responsable des variations dans le métabolisme du CPT-11 en fonction des individus.
* L'azathioprine, la 6-mercaptopurine et la 6-thioguanine. Le cas de la 6-mercaptopurine (6-MP) demeure intéressant dans le domaine de la pharmacogénétique des composés anticancéreux, car les mécanismes moléculaires ont été partiellement définis par Krynetski et al. [42]. Cette molécule est plus particulièrement utilisée dans le traitement d'entretien des leucémies aiguës lymphoblastiques. La 6-MP est inactivée par S-méthylation, une réaction catalysée par l'enzyme thiopurine méthyltransférase (TPMT). Le polymorphisme génétique concernant cette enzyme TPMT a permis de classer les patients en 3 groupes [43, 44]. La déficience en TPMT profonde définie comme homozygote en raison de l'activité de l'enzyme est rare (1/300), mais les conséquences cliniques peuvent en être graves, exposant le malade à un risque toxique majeur vis-à-vis de la 6-MP et du composé immunosuppresseur analogue qu'est l'azathioprine [43, 45]. La deuxième population présente un niveau d'activité TPMT intermédiaire, et est définie au point de vue phénotypique comme hétérozygote. Cette population montre une variation importante dans l'activité TPMT qui peut être reliée directement à la formation du composé nucléotidique 6-thioguanine (6-TGN) [46] et à la réponse thérapeutique [43]. Enfin, les patients qui présentent une activité TPMT élevée peuvent être résistants à la 6-MP et tolérer des doses élevées de cette molécule, sans effets toxiques myélosuppresseurs [43].
Des progrès dans l'élucidation du polymorphisme de l'enzyme TPMT ont pu être réalisés grâce à la purification de cette enzyme et secondairement grâce au clonage de l'ADNc codant pour cette enzyme [47]. Krynetski et al. [42] ont mis en évidence une mutation dans l'ADNc codant pour la TPMT, isolé à partir d'un patient présentant une déficience dans cette enzyme. L'étude de la séquence nucléotidique de l'ADNc du patient déficitaire a permis de mettre en évidence une mutation ponctuelle G * C qui entraîne l'apparition d'une substitution dans la séquence acide aminé de type Ala * Pro. Afin d'évaluer l'importance de cette mutation dans la déficience en TPMT, ces auteurs ont utilisé un système d'expression (levure) qui a permis de montrer que cette mutation diminuait d'un facteur 100 l'activité de cette enzyme. La transmission héréditaire de cette mutation a été confirmée par la mise en évidence de la même substitution nucléotidique dans l'ADN génomique de la mère du patient. Ce travail présente une avancée importante dans l'explication de la déficience en TPMT et participera probablement à l'élaboration de tests moléculaires permettant de déterminer, avant administration de 6-mercaptopurine ou d'azathioprine, si le patient est déficitaire dans l'enzyme TPMT.
* Le 5 fluoro-uracile (5FU). Cet antimétabolite a été introduit en clinique il y a un peu plus de 30 ans ; les paramètres cliniques et biologiques de cet agent ont été extensivement étudiés. Ainsi, les connaissances sur les variations pharmacogénétiques du 5FU sont avancées par rapport à d'autres molécules anticancéreuses. Le 5 fluoro-uracile est un agent cytotoxique couramment utilisé dans des pathologies néoplasiques concernant le sein, le côlon et les voies aérodigestives supérieures. Le rôle important de l'enzyme DPD (dihydropyrimidine déshydrogénase) au cours de l'administration de 5FU a été démontré dans plusieurs études. Il a été montré que la déficience en DPD prédisposait les patients à une toxicité importante parfois mortelle, après administration de 5FU. La DPD est la première enzyme intervenant dans le catabolisme des bases pyrimidiques et donc du 5FU. Cette enzyme catalyse la réaction suivante : pyrimidine + NADPH * dihydropyrimidine + NADP+. Cette transformation des bases pyrimidiques est la première réaction dans les 3 étapes qui conduisent à la conversion de l'uracile en ß-alanine ; cette voie métabolique est la seule qui conduise à la synthèse de ß-alanine chez les mammifères [48]. Compte tenu de l'importance de cette enzyme, de nombreuses études ont eu pour but de potentialiser l'activité du 5 fluoro-uracile par l'adjonction d'inhibiteurs de la DPD [49]. De nouvelles molécules comme l'éthynyluracile augmentent l'activité cytotoxique quand elles sont coadministrées à de faibles doses de 5FU. Sur la base de ces premiers résultats précliniques, l'éthynyluracile est en cours d'évaluation dans des études cliniques de faisabilité.
En 1988, Diasio et al. [50] ont décrit le cas d'un patient qui avait présenté une toxicité considérée comme sévère après administration de 5FU. L'étude de l'activité DPD dans les cellules mononucléaires chez le patient et les membres de la famille démontrait une déficience dans l'enzyme DPD ; cette déficience se transmettait selon un mode autosomique récessif (figure 1) [50]. Cette dernière donnée fut établie sur la mesure de l'activité DPD et non pas au niveau moléculaire (ADN), car le gène codant pour la DPD ne fut cloné que plus tard. Depuis ces premiers cas, il a été rapporté les cas de 12 patients supplémentaires présentant une déficience en DPD. En raison des résultats de l'activité DPD, il a été suggéré que les patients classés comme profondément déficitaires étaient homozygotes et que les autres patients classés comme déficitaires simples étaient hétérozygotes pour le déficit [51].
Afin d'évaluer la distribution de l'activité DPD et de déterminer si un polymorphisme génétique pour l'enzyme DPD existe, plusieurs études ont été entreprises dans la population générale et chez les patients atteints de cancer. Une étude récente portant sur 124 sujets sains (45 % d'hommes et 55 % de femmes) démontrait une distribution de l'activité DPD, mesurée sur les cellules mononucléaires, suivant une loi normale, avec des variations pouvant aller jusqu'à un facteur 4 [52]. Les différences dans l'activité DPD n'étaient pas dues au sexe, à l'âge ou à l'origine ethnique. Plus récemment, Lu et al. [53] reportaient les résultats préliminaires portant sur une population de 151 femmes atteintes d'un adénocarcinome mammaire. La distribution de l'activité DPD était similaire à la population générale. Par contre, l'activité moyenne DPD était significativement inférieure à celle observée dans la population générale. Sur ces
151 patientes, 3 (2 %) avaient une activité DPD qui était inférieure à la limite définie par l'intervalle où l'on peut classer 95 % de la population. Ces dernières patientes étaient donc classées comme déficitaires en DPD.
Il existe un autre type de déficience en DPD décrit par Brocksted et al. [54] et qui atteint de jeunes enfants. Dans ce cas, la déficience en DPD s'intègre dans un syndrome appelé « thymine-uracilurie », caractérisé par des malformations morphologiques mineures et des symptômes neurologiques [55]. L'activité DPD de ces enfants est pratiquement nulle ; au point de vue biochimique, il est possible de noter une accumulation de l'uracile et de la thymine dans les urines [55, 56], dans le sang [56] et dans le liquide céphalo-rachidien [56]. Dans quelques cas, le 5-hydroxyméthyluracile, un métabolite de la thymine, est aussi excrété [57].
À l'aide de la séquence en acides aminés des peptides dérivés de la protéine DPD purifiée à partir du bovin, Albin et al. [58] ont été en mesure de cloner l'ADNc codant pour la DPD dans cette même espèce et secondairement de cloner l'ADNc codant pour la DPD à partir des lymphocytes humains [59]. Une publication récente de Yokota et al. [60] a fait état du clonage de l'ADNc codant pour la DPD isolé à partir du foie de porc et du foie humain. Albin et al. [61] ont mis en évidence une mutation dans l'ADNc codant pour la DPD, isolé à partir des lymphocytes d'un patient présentant une déficience dans cette enzyme. L'étude génotypique de cette mutation située en position 2894 (numérotation selon la séquence soumise à GenBank, numéro d'accès : U20938) a permis de démontrer que la patiente était homozygote, alors que les parents étaient hétérozygotes pour cette variation nucléotidique. Une identité phénogénotypique a donc été obtenue pour cette mutation, ce qui renforce l'intérêt de l'étude de cette variation nucléotidique. La fréquence de cette mutation a été étudiée chez 25 individus présentant une activité DPD normale et n'a pas été identifiée dans cette population. Meinsma et al. [62] ont décrit également une mutation (délétion de 165 paires de bases) chez les enfants atteints du syndrome thymine-uracilurie. Cette même délétion apparaît pour ces auteurs comme responsable du syndrome thymine-uracilurie mais aussi de la déficience en DPD classiquement identifiée chez les patients recevant du 5FU [63]. Ce dernier point reste troublant car ces 2 types de déficience en DPD diffèrent sur bien des éléments cliniques et biologiques.
Ces travaux représentent la base de l'étude du polymorphisme génétique impliquant l'enzyme DPD et le 5FU ; ces données sont indispensables à l'élucidation de ce polymorphisme génétique mais ne permettent pas d'en définir la cause moléculaire exacte. La complexité de cette thématique, associée aux différentes voies de recherche qu'il convient maintenant d'explorer, permet de mesurer la difficulté des études concernant la pharmacogénétique. Ces travaux sont indispensables et devraient autoriser à l'avenir une meilleure utilisation de cette molécule grâce à la mise au point de tests génotypiques visant à prévenir ou à réduire la toxicité de ce médicament.
Métabolisme intratumoral
Comme la définition d'une variation pharmacogénétique peut inclure les variations génétiques entre l'hôte et le tissu tumoral, ces mêmes variations peuvent être utilisées comme cible potentielle pour améliorer la sélectivité des agents chimiothérapiques. Une telle sélectivité a déjà été obtenue pour des agents qui agissent spécifiquement sur des cellules tumorales exprimant une protéine cible altérée par rapport à la cellule normale. Des cibles comme les récepteurs hormonaux, les antigènes de surface et les enzymes impliquées dans la réplication cellulaire sont surexprimées dans certaines tumeurs et permettent d'obtenir un certain degré de sélectivité. Par contre, la cytotoxicité sélective due à des différences dans le métabolisme des médicaments entre l'hôte et le tissu tumoral est encore assez peu exploitée. Si des différences dans le métabolisme des médicaments peuvent être identifiées entre l'hôte et le tissu tumoral, elles donneront une cible supplémentaire utile afin d'obtenir une meilleure sélectivité antitumorale [64].
Des différences entre l'hôte et le tissu tumoral peuvent être innées ou acquises pendant la chimiothérapie en raison de la pression sélective induite par les molécules cytotoxiques administrées. Des changements dans le métabolisme des molécules ou dans le transport ont été associés à l'apparition de résistance vis-à-vis des agents cytotoxiques. Ces changements qui ont pour conséquence d'inactiver une molécule pour laquelle certaines cellules sont résistantes peuvent être exploités pour détourner cette résistance. Une approche possible pour exploiter les différences dans le métabolisme des médicaments entre cellules malignes et bénignes est donnée lors de l'étude du niveau d'expression du CYP 1A dans des cellules d'adénocarcinomes mammaires et des cellules non tumorales entourant la tumeur [65]. Ces résultats permettent d'envisager de donner des agents activés par le CYP 1A comme traitement de ces tumeurs et ainsi d'augmenter la sélectivité antitumorale.
L'activité GST-µ a été étudiée dans un nombre important de tissus tumoraux, comme le sein [66], le côlon [67], les voies aérodigestives supérieures [68], le pancréas [69], les lymphomes [70], les leucémies aiguës lymphoblastiques [71] et le poumon [72]. Au vu du nombre important d'études et de la variabilité de l'expression de la GST-µ en fonction du tissu, du type de tumeur, de la taille de la tumeur [73], il apparaît difficile d'effectuer une synthèse globale de ces différents travaux. Les éléments apportés par ces études sont que le polymorphisme de la GST-µ a été mis en évidence dans l'ensemble de ces tissus tumoraux et que l'activité GST-µ est parfois augmentée dans le tissu tumoral (sein, poumon et tumeur ORL) par comparaison au tissu péritumoral, mais cette notion diffère avec le type de tumeur étudiée. Hall et al. [74] ont étudié la relation entre la GST-µ et la réponse à la chimiothérapie. Ces auteurs ont mis en évidence une relation entre l'activité GST-µ mesurée dans les cellules blastiques et la survie sans rechute chez des enfants traités pour une leucémie aiguë lymphoblastique. De façon similaire, Herbergs et al. [75] ont étudié le système glutathion dans les érythrocytes de patients traités pour des carcinomes ORL et ont mis en évidence une corrélation entre ce système et la réponse à la chimiothérapie.
La relation entre l'activité DPD mesurée dans les cellules mononucléaires et la clairance du 5FU a été étudiée par Fleming et al. [76] ; ces derniers ont montré une corrélation linéaire entre ces 2 paramètres. Ces données tendent à montrer que l'enzyme DPD peut jouer un rôle déterminant dans la réponse clinique observée après administration de 5FU. Beck et al. [77] ont montré, sur des lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l'activité TS (thymidylate synthétase) et DPD ont été mesurées et comparées à la cytotoxicité du 5FU, que l'activité DPD était significativement corrélée à la sensibilité au 5FU : plus l'activité DPD était faible et plus les cellules étaient sensibles à la molécule. In vivo, une étude récente a montré une relation entre l'activité DPD intratumorale et la réponse à la chimiothérapie chez des patients traités pour des carcinomes de la sphère ORL [78].
Remerciements
Nous tenons à remercier l'Association pour la recherche sur le cancer (ARC) pour sa participation financière qui nous a permis de continuer cette thématique de recherche.
CONCLUSION
Les nouvelles techniques de biochimie et de biologie moléculaire permettent de déterminer les mécanismes d'action d'une molécule et les bases moléculaires des facteurs (individu et tumeur) qui influencent son action. À ce jour, les 2 exemples qui permettent une application du concept pharmacogénétique dans la chimiothérapie anticancéreuse ont été décrits pour la 6-mercaptopurine et le 5 fluoro-uracile. Ces résultats ont pu être obtenus grâce à une étude extensive du métabolisme de ces médicaments et à la mise en évidence d'enzymes clés intervenant dans le métabolisme de ces molécules. Secondairement, des corrélations entre l'activité de ces enzymes clés (DPD, TPMT) et les effets cliniques de la molécule ont été décrites. La mise en évidence des gènes responsables de la synthèse de ces enzymes a permis de définir ces concepts pharmacogénétiques au niveau génotypique et d'ainsi pouvoir envisager, à court terme, la détermination génotypique et préthérapeutique du profil toxique de la molécule administrée. La pharmacogénétique apparaît être un élément important dans la variabilité de la toxicité ou de la réponse antitumorale vis-à-vis d'agents chimiothérapiques. La détermination complète des bases moléculaires impliquées dans ces variations permettra certainement d'améliorer nos connaissances sur la pharmacologie de la tumeur et de l'individu et ainsi de contribuer à l'optimisation de la prescription anticancéreuse.
Il est probable qu'au cours du xxie siècle nous verrons disparaître en oncohématologie le dogme de la prescription chimiothérapique en fonction de la surface corporelle, au bénéfice d'une prescription plus personnalisée adaptée à chaque individu [79]. L'objectif de cette prescription est d'obtenir la concentration optimale d'une molécule pour chaque patient. Une telle approche pourra aussi être utilisée afin de tenir compte des variations pharmacogénétiques et/ou de l'importance de l'activation métabolique. Elle nécessitera une bonne compréhension des relations entre la molécule mère, les différents métabolites et une évaluation précise des interactions entre l'hôte et la tumeur. L'acquisition de ces informations est particulièrement difficile, étant donné le nombre important d'individus nécessaires pour caractériser un polymorphisme génétique, et aussi en raison de l'extrême variabilité qui caractérise le tissu tumoral. Des techniques, comme celles qui consiste à prélever un échantillon de sang à un temps considéré comme optimal, ou à évaluer les effets cytotoxiques à des temps intermédiaires, peuvent permettre de valider ces données sur une grande population. Malheureusement, ces données doivent être interprétées avec précaution, car la complexité des modèles utilisés et la difficulté à mesurer le composé chimique ou la réponse pharmacologique appropriée peuvent invalider toute tentative d'individualisation.
